注意：本產品試劑組分和操作步驟發生變化，使用前請仔細閱讀說明書。 

保存：本產品對光敏感，應該室溫避光儲存，保質期 2 年。無菌開封后，保存于室溫。 

試劑盒組成： 

試劑 A 200mL 室溫避光 

試劑 C 100mL 室溫避光 

紅細胞沉降液 100mL 室溫 

細胞洗滌液 200mL 室溫 

操作步驟一： 紅細胞沉降（僅供參考） 

沉降去除紅細胞：

取腫瘤浸潤組織單細胞懸液與血液稀釋液(注射用生理鹽水或 1XPBS)及紅細胞沉 降液按照 1:1:1 比例混勻，室溫下靜置 30-40min 后，可見紅細胞沉于試管底部，小心吸取上清層(富 含白細胞及血小板)用于后續細胞分離。 

操作步驟二： 樣本分離（僅供參考） 

1. 樣本分離：當樣本體積小于 5mL 時,先在離心管中先加入 4mL 試 劑 A，后將 2mL 試劑 C 小心疊加于試劑 A 之上，形成梯度界面(樣 本體積大于等于 5mL，試劑 A 與試劑 C 比例 2:1，試劑總量等于沉 降后樣本含量),將懸液小心平鋪于分離液液面上方。由于密度差異， 可見明顯的分層界面(注意二者的總體積不能超過離心管的三分之二， 否則會影響分離效果)。 

2. 室溫條件下水平轉子 600-1000g ，25-30min(血液體積越大所需離 心力越大,離心時間越長,最佳分離條件需摸索，離心最大轉速不超過 1000g)。

3. 離心后，離心管中可見兩個環狀乳白色層，上層為單個核細胞層,下層即所需中性粒細胞層(受 個體差異及分離條件影響，粒細胞白膜層可能會出現顏色較淺的情況)。 

4. 用吸管吸取下層中性粒細胞白膜層至新的離心管中，加入 10mL 細胞清洗液洗滌細胞，250g，離 心 10min。 

5. 棄上清,加入 5mL 細胞清洗液重懸細胞,250g，離心 5min。 

6. 棄上清，重懸細胞備用。 

腫瘤浸潤組織單細胞懸液制備方法（僅供參考） 

腫瘤浸潤組織研磨的方法： 

1. 無菌條件下摘取腫瘤浸潤組織，撕去臟器被膜，用眼科剪將臟器組織剪成小塊。 

2. 將尼龍篩網或者是細胞過濾篩放置于平皿上，加入少量全血及組織稀釋液（保證脾臟及獲得的 細胞處于液體環境中）。 

3. 將臟器組織放置于篩網上，使用注射器活塞或者是無菌鑷子來研磨脾臟（盡量控制研磨力度， 保持篩網懸空，避免在皿底上直接研磨而造成大批細胞死亡） 

4. 研磨完全后使用全血及組織稀釋液沖洗篩網，收集細胞懸液，再經濾網過濾。 

注： 

A. 可用酶消化法，使用膠原酶對腫瘤浸潤組織進行消化，得到單細胞懸液。 

B. 如果最終得到的細胞需要培養，那全過程所需試劑與器材均要求無菌。 

C. 根據腫瘤浸潤組織的體積控制單細胞懸液的濃度在 10 8 ~10 9個/mL。 

注意事項： 

A.開封前顛倒混勻，本分離液為無菌產品，為延長分離液保存時間，請在無菌條件下啟封，避免 微生物污染。 

B.分離液使用時應始終保持室溫（18℃~25℃），如室內溫度較低，可將分離液預熱。4℃或者是溫 度較低的條件下離心，可能會導致白膜層不清晰。 

C.血液樣本最好為新鮮抗凝血（采血 2h 以內），為保持中性粒細胞的活性，應避免冷凍和冷藏。 

D.稀釋血液或洗滌細胞，不可使用含 Ca、Mg 離子的緩沖液及培養液，其成分會導致血細胞凝集， 大大降低細胞得率及純度。 

E.部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其帶有的靜電作用，可能會導致細胞掛壁，影響分離效果。 

F.血液樣本的粘稠度或者是溫度差異，可能會影響分離效果，可以調節離心轉數和離心時間，摸索 最佳的分離條件。 

G.如果要進一步對分離的細胞進行培養，注意全程保持無菌操作，避免微生物污染。 

H.不同動物血液在不同比重分離液中的細胞離散系數及細胞帶電不同，用戶在制定分離液時應提 供所需分離液的比重、動物種屬及被分離細胞的名稱。

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標題:A lipid starvation strategy-synergized neutrophil activation for postoperative melanoma immunotherapy

成員:Hongjuan Zhao, Mengya Niu, Yuxin Guo, Qing Li, Yinke Wang, Qianqian Jiang, Qingling Song, Yi Zhang, Lei Wang

論文因子:10.5 發表期刊:JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE pmid:39952297

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標題:Endothelial EGLN3-PKM2 signaling induces the formation of acute astrocytic barrier to alleviate immune cell infiltration after subarachnoid hemorrhage

成員:Duan Mingxu, Ru Xufang, Zhou Jiru, Li Yuanshu, Guo Peiwen, Kang Wenbo, Li Wenyan, Chen Zhi, Feng Hua, Chen Yujie

論文因子:7.3 發表期刊:Fluids and Barriers of the CNS pmid:38755642

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標題:Tumor associated neutrophils governs tumor progression through an IL-10/STAT3/PD-L1 feedback signaling loop in lung cancer

成員:Shuai Zhang, Lei Sun, Jingfang Zuo, Dongjie Feng

論文因子:5 發表期刊:Translational Oncology pmid:38128466

注意：以上文獻 僅供參考

小鼠腫瘤浸潤組織中性粒細胞分離液試劑盒

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